système lipolytique d’un animal primitif marin: le crabe vert

système lipolytique d’un animal primitif marin: le crabe vert

 

Introduction

Les lipases ou triacylglycérol hydrolases (E.C.3.1.1.3), largement répandues chez tous les êtres vivants (Taipa et al., 1992), ont l’avantage d’être disponibles en grande quantité et à faible coût, d’être sélectives vis-à-vis de leurs substrats et de ne pas nécessiter de cofacteurs. Ces enzymes présentent de ce fait une grande importance en biotechnologie. Elles sont de plus en plus utilisées dans les domaines médical, thérapeutique, chimique et alimentaire (Ghandi, 1997). L’étude de ces enzymes a contribué à l’élaboration d’une enzymologie interfaciale, la catalyse se produit en milieu hétérogène à l’interface huile-eau (Verger et al., 1973 ; Ransac et al., 1990). Il en résulte que les propriétés biochimiques de ces enzymes dépendent autant de la « qualité » de cette interface que de certains paramètres classiques tels que le pH ou la force ionique.

Chez les animaux supérieurs, plusieurs lipases sont produites à différents niveaux du tube digestif. Ces lipases jouent un rôle fondamental dans le métabolisme lipidique en permettant l’absorption des lipides alimentaires.

La plupart des recherches actuelles, réalisées sur la famille génétique des lipases sont focalisées sur les animaux supérieurs. On ignore jusqu’à ce jour le mode d’action du système lipolytique des animaux primitifs marins. Pour cette raison nous nous sommes intéressés, dans ce présent travail, à la purification et à la caractérisation biochimique de la lipase de crabe vert impliquée dans la digestion des lipides alimentaires.

La caractérisation biochimique de la lipase digestive de crabe, nous permettra de la comparer avec les lipases connues des animaux supérieurs et de l’exploiter si elle présentera des caractéristiques nouvelles recherchées.

I- Les enzymes lipolytiques

1- Introduction

Les enzymes lipolytiques forment une classe d’enzymes parfaitement solubles dans l’eau. Elles sont responsables de l’hydrolyse des lipides. Elles agissent sur des substrats lipidiques insolubles dans l’eau mais qui s’organisent spontanément au contact de l’eau pour former des émulsions, des micelles, des liposomes ou des films monomoleculaires.

Les lipases ou triacylglycerols acylhydrolases (EC.3.1.1.3) forment une famille hétérogène d’enzymes qui catalysent, en milieu hétérogène, la réaction d’hydrolyse des liaisons esters de triacylglycerols.

Les lipases sont des estérases capables d’hydrolyser des substrats insolubles tels que les glycérides à longues chaînes (Verger, 1985).

Leur polarité vient du fait de leur comportement cinétique (Sarda et Desnuelle, 1958) car l’hydrolyse des lipides insolubles dans l’eau est beaucoup plus rapide lorsqu’elles sont sous formes de micelles, d’où le phénomène d’activation interfaciale qui les différencie des estérases.

Figure 1 : liaisons esters carboxyliques des triacylglycérols hydrolysables par les lipases

2- Cinétique enzymatique de la lipolyse

Contrairement à la plupart des enzymes qui agissent en phase aqueuse, les lipases agissent en milieu hétérogène, à l’interface lipide/eau, où elles s’y adsorbent. Il en résulte que les propriétés biochimiques de ces enzymes dépendent autant de la « qualité » de cette interface que des paramètres plus classiques tels que le pH ou la force ionique.

Les activités catalytiques des lipases sont étroitement dépendantes de la pression de surface en présence d’agents tensioactifs tels que les sels biliaires et certaines protéines alimentaires. Cette modulation peut s’exercer soit sur l’étape d’adsorption de l’enzyme à l’interface soit sur l’étape de catalyse interfaciale (figure 2).

L’enzymologie conventionnelle, basée sur le modèle de Michaelis et Menten, ne peut pas être directement appliquée dans le cas des réactions qui se déroulent en milieu hétérogène. C’est pourquoi, après avoir examiné le mode d’action de plusieurs lipases, une enzymologie interfaciale a été développée par Verger et de Haas (Verger & de Haas, 1973).

E* E*S P

E*

Kd Kp

E

Emulsion d’huile

Interface huile/eau

Figure 2 : Modèle cinétique interfaciale. La réaction enzymatique est décomposée en deux étapes (Verger & de Haas, 1973) :

1- La première est l’adsorption de l’enzyme (E) à l’interface huile-eau (E*). Cette réaction partielle est régie par deux constantes de vitesse Kp et Kd, représentant respectivement la pénétration de l’enzyme à l’interface et la désorption de l’enzyme.

2- La deuxième résulte de la formation d’un complexe enzyme-substrat (E*S), ayant la dimension d’une concentration surfacique (mole/m2). Le modèle de Michaelis-Menten est alors établi dans un plan.

Le critère de l’activation interfaciale n’est pas relié obligatoirement à la présence du volet. Il n’est ni nécessaire ni suffisant pour définir une estérase comme une lipase (Ferrato et al., 1997). Actuellement, il est admis que le critère expérimental le plus sûr pour discriminer une lipase d’une estérase est la capacité d’hydrolyser les triacylglycérols à chaînes longues.

Sayari et al., (2001) ont montré que la lipase de Staphylococcus aureus NCTC 8530 (SAL1) est une vraie lipase malgré qu’elle n’hydrolyse pas une émulsion d’huile d’olive. En effet cet enzyme possède un pouvoir de pénétration lui permettant de s’adsorber et de dégrader la dicaprine déposée sous forme de couches monomoleculaires à 35 mN.m-1. Les mêmes auteurs ont conclu que les films monomoléculaires peuvent être utilisés comme critère pour différencier les lipases qui sont incapables d’hydrolyser les triacylglycérols à chaînes longues, des estérases.

II- Les lipases du monde marin

Plusieurs projets de recherche ont focalisé leurs objectifs sur l’étude de la physiologie de la lipolyse de certains animaux marins. En effet, chez les espèces de poissons téléostéens, des études ont montré que les lipases dépendantes de sels biliaires jouent un rôle important dans la digestion des lipides (Gjellesvik et al., 1992). La lipase isolée à partir du caecum pylorique de la morue atlantique nécessite la présence de sels biliaires pour hydrolyser les triacylglycérols insolubles. Cet enzyme, 1,3 spécifique, agit à un pH optimal de 8,25 et une température optimale de 25°C. Patton et Nevenzel (1974) ont décrit la présence de deux lipases pancréatiques différentes et actives chez le petit requin, une lipase non spécifique activée par les sels biliaires et une autre montrant une spécificité pour les esters primaires (positions 1 et 3). Des résultats similaires ont été obtenus par Tocher et Sargent (1984) sur une autre espèce : la Salmogairdnerii.

Chez l’espèce Cyprinron macrostomus, une lipase a été isolée à partir des intestins qui agit entre pH 6,5 et 9. Sa masse moléculaire est de l’ordre de 50 kDa et son activité spécifique est de 254 U/mg (Dejerli et Akpinar, 2002).

Tableau 1 : Localisation tissulaire de l’activité lipasique chez certains animaux marins.

Espèce animale

Description

Tissu contenant l’activité lipasique

Présence de colipase

Présence de sels biliaires

Références

Morue

(Gadus morhua)

Poisson osseux

Pancréas discret

+

nd

Brokerhoff

1970

Raie

(Raja radita)

Poisson cartilagineux

Pancréas discret

+

+

Brockerhoff 1970

Ecrevisse

(Cherax uadricarnitus)

Arthropode

(crustacé)

Hépatopancréas

_

_

Brokeroff

1970

Homard

(Homorus americanus)

Arthropode

(crustacé)

Hépatopancréas

nd

nd

Brokerhoff

1970

Lombric

(Lumbrcus terrestus)

Annélide

Non spécifié

nd

nd

Brokerhoff

1970

III- Les Crabes

1- Position systématique

Selon la classification des crustacés donnée par Beaumont et Cassier (1973), les crabes se placent dans la position taxonomique suivante :

Ils font partie de l’embranchement des Arthropodes puisqu’ils possèdent des appendices articulés et un système nerveux ventral. Ils appartiennent à la classe des crustacés vue qu’ils ont une cuticule incrustée de sels et de minéraux et leurs organes extérieurs ont une disposition segmentaire. Les crabes intègrent la sous-classe des eucaridea, l’ordre des décapodes et l’infra-ordre de brachyoures.

2- Morphologie des crabes

Les crabes sont caractérisés par leur céphalothorax qui constitue la plus grandes partie du corps, et qui, au dessous duquel se trouve replié l’abdomen réduit. Le céphalothorax porte vers l’avant une paire de pédoncules oculaires, une paire d’antennules, une paire d’antennes, ventralement six paires de pièces buccales et latéralement cinq paires de péréiopodes (Bauchau, 1966). L’abdomen porte cinq paires de pléopodes réduits.

3- Système digestif

L’appareil digestif des arthropodes est généralement constitué d’un intestin antérieur, un intestin moyen et un intestin postérieur. L’intestin antérieur, comprend la bouche, l’oesophage et l’estomac. L’intestin moyen du crabe est sous forme d’un grand tube présentant des dérivations qui constituent le caecum digestif. L’intestin postérieur est formé par l’intestin tubulaire, le rectum et l’anus.

Le caecum digestif de couleur noirâtre ou jaunâtre selon l’alimentation, constitue l’hépatopancréas. Ce dernier occupe la partie antérieure de la carapace, sur les chambres branchiales et entoure le coeur et les gonades. A l’entrée de la bouche, les mandibules coupent l’aliment en petites pièces qui passeront ensuite au niveau de l’estomac où se déroule l’hydrolyse par le biais des enzymes secrétés par l’hépatopancréas à travers un canal.

L’absorption des produits d’hydrolyse et le stockage des nutriments se déroulent au niveau de l’intestin moyen.

Hépatopancréas

Gonades

Chambres branchiales

Anus

Figure 3: Hépatopancréas de crabe en noir

I- Matériel

1- Réactifs

Le deoxycholate de sodium (NaDC), le taurodeoxycholate de sodium (NaTDC), le persulfate d’ammonium, le N,N,N’,N’-tétramétyl-éthylène diamine (TEMED), le tris (hydroxyméthyl aminométhane (Tris-HCl), l’acide éthylène diamine tétra-acétique (EDTA) et le sérum albumine bovine (BSA) sont de Sigma Chemical Company (St. Louis, USA). La tributyrine (TC4) (pureté 99 %) et la benzamidine sont de Fluka (Bucks, Suisse). Le sodium dodécyl sulfate (SDS), l’acrylamide et la bisacrylamide sont de Bio-Rad (Paris, France). La gomme arabique (GA) est de Mayaud Backer LTD (Royaume Unis). L’acétate de vinyle est de Aldrich (Steinheim , Allemagne).

2- Animaux

Les Crabes vert (Carcinus mediterranus) sont ramassés vivants à la cote de Sidi Mansour (Sfax) et les hépatopancréas sont collectés immédiatement puis stockés à -20°C.

3- Protéines

Le sérum albumine bovine est de Sigma ; la lipase pancréatique de dinde est gracieusement fournie par Ahmed FENDRI (LBGEL) ; la lipase digestive de scorpion et les anticorps anti-SDL et anti-TPL de lapin sont gracieusement fournis par Nacim ZOUARI (LBGEL) ; la colipase de dromadaire est gracieusement fournie par Abir BEN BACHA (LBGEL).

4- Supports chromatographiques

Le séphacryl S-200, la Mono-Q Sépharose et la DEAE-cellulose sont de Pharmacia Chemicals (Uppsala, Suède). Les gels sont utilisés selon les instructions du fournisseur.

5- Appareillage

Le pH-Stat est de Metrohm (Suisse). Le spectrophotomètre à longueur d’ondes variable est de Cecil CE 1020 (Royaume Unis). L’appareil d’électrophorèse est de Bio-Rad (France). Le bain-marie est d’Aplex (France). Le collecteur de fraction et la pompe péristaltique sont de Pharmacia LKB (Suède). La centrifugeuse AllegraTM 21R est de Beckman (USA). La cellule d’ultrafiltration est d’Amicon (Suède).

II- Méthodes

1- Dosage de l’activité lipolytique

L’activité lipolytique est mesurée à pH 8 par titration des acides gras libérés avec du NaOH 100 mM à l’aide d’un pH-Stat (Gargouri et al., 1986). Le substrat utilisé est une

émulsion d’huile d’olive à 10 % (10 ml d’huile d’olive dans 90 ml de gomme arabique à 10 %), le test contient 10 ml d’émulsion, 20 ml d’eau distillé. Dans le cas du test avec la tributyrine (TC4), le milieu de dosage standard contient 250 ul de TC4 dans 30 ml tampon Tris-HCl 2 mM, pH 8. L’activité enzymatique est exprimée en unité internationale (UI). Une unité d’activité lipolytique correspond à la libération d’une umole d’acide gras par minute.

2- Dosage de l’activité phospholipasique

L’activité phospholipasique est mesurée à l’aide d’un pH-stat, à pH 8 et à 60°C par titration des acides gras libérés avec NaOH 100 mM, suite à l’hydrolyse du substrat . Le substrat utilisé est une émulsion de phosphatidylcholine. Le test contient 10 ml d’émulsion et 20 ml tampon Tris-HCl 2 mM, DOC 6 mM et CaCl2 7 mM. L’activité phospholipasique est exprimée en unité enzymatique qui correspond à la libération d’une micromole d’acides gras par minute.

3- Détermination de la concentration en protéines

La concentration de protéines est déterminée selon la méthode spectrophotométrique décrite par Bradford (1976) en utilisant le sérum albumine bovine comme standard, dont le coefficient d’extinction molaire E1%1cm est de 6,7.

4- Effet de la température sur l’activité lipasique

L’influence de la température sur l’activité de l’enzyme a été étudiée en mesurant l’activité à pH 8 et à différentes températures en utilisant la tributyrine comme substrat.

5- Effet du pH sur l’activité lipasique

L’activité lipasique est mesurée sur une émulsion de tributyrine à température optimale et à différents pH.

6- Stabilité de la lipase de crabe en fonction de la température

La stabilité de l’enzyme en fonction de la température a été étudiée en incubant l’enzyme à différentes températures pendant 10 min. Après centrifugation l’activité lipasique est mesurée dans le surnageant dans les conditions optimales.

7- Stabilité de la lipase de crabe en fonction du pH

L’enzyme a été incubé à différents pH variant de 3 à 10 en utilisant différents tampons. Après 10 min d’incubation, l’échantillon est centrifugé pendant 5 min à 10 000 rpm et l’activité lipasique est mesurée dans les conditions optimales dans le surnageant.

8- Effet des ions calcium

Les mesures de l’activité lipolytique sont effectuées sur une émulsion d’huile d’olive et sur la tributyrine en présence de concentrations croissantes en CaCl2 dans les conditions optimales de pH et de température. En absence de calcium, l’activité lipolytique est mesurée en présence de 10 mM EDTA.

9- Effet du détergent naturel sur l’activité lipasique

L’effet du NaDC sur l’activité lipasique a été réalisé en mesurant l’activité de l’enzyme sur la tributyrine ou l’huile d’olive comme substrat. Le test est effectué dans les conditions optimales de température et de pH.

10- Dosage des sels biliaires dans l’hépatopancréas de crabe

C’est une méthode de dosage enzymatique qui se base sur l’utilisation de 3á hydroxy stéroide déshydrogénase (Sigma).

a) Préparation de la solution (Enzyme/NAD+) au moment de l’expérience

Pour préparer une solution (Enzyme/NAD+) avec une concentration diluée au 1/100 par rapport au stock soit 0.05 U/ml, on mélange 2 ml H20 contenant 2 mg NAD+ avec 2 ml tampon (30 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA , pH 9,4) contenant 0,2 U de la déshydrogénase.

b) Dosage des échantillons

On mélange 400 ul de l’échantillon d’hépatopancréas dilué au 1/100 avec 600 ul de la solution d’enzyme préalablement préparée. Après incubation de l’échantillon pendant 1 h à 37°C, on mesure l’absorbance à 340 nm contre un blanc contenant 400 ul d’échantillon et 600ul H20.

Une gamme étalon est préalablement préparée dans les mêmes conditions avec des concentrations de taurodéoxycholate de sodium variant de 0,005 à 0,5 mM.

11-Analyse des protéines par électrophorèse et immunorévélation

La pureté des protéines est suivie par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 12 %, en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS) (Laemmli, 1970).

Pour l’immunorévélation, les protéines sont électrotransférées sur une membrane de nitrocellulose à partir du gel de polyacrylamide, pendant 1heure sous une tension de 220V, dans un tampon 20 mM Tris-HCl, 150 mM glycine et 20 % de méthanol. La qualité de transfert est vérifiée par coloration transitoire des protéines au rouge ponceau (0,2% dans l’acide trichloracétique 3 %). Pour empêcher toute fixation non spécifique des anticorps, la membrane est préalablement saturée par incubation pendant 1heure dans une solution contenant 3 % de poudre de lait lyophilisé (Régilait, Nestlé) dans le tampon PBS-Tween 20 (8 g/l NaCl ; 0,1 g/l KH2PO4. ; 2,9 g/l Na2HPO4,2H2O ; 0,05 % Tween 20), à température ambiante. Après plusieurs lavages avec le tampon PBS-Tween 20, la membrane est incubée pendant 1heure à température ambiante avec l’anticorps anti-SDL ou anti-TPL (2ug/ml). L’excès d’anticorps est ensuite éliminé par trois lavages de 10 min avec le tampon PBS-Tween 20. Après le dernier lavage, la membrane est incubée pendant 1heure avec un deuxième anticorps anti-IgG couplé à la phosphatase alcaline (Sigma) et dilué au 1/2000 dans le tampon PBS-Tween 20. Ce deuxième anticorps est spécifique des IgG de lapin. La membrane est ensuite lavée trois fois avec le tampon PBS-Tween 20 et deux fois avec un tampon 0,1M Tris-HCl, 0,1M NaCl, 1mM MgCl2, 5mM 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate alcalin avec son substrat qui génère un précipité violet sur la membrane au niveau des bandes reconnues. La réaction est arrêtée par plusieurs lavages avec de l’eau distillée.

I- Niveau des enzymes lipolytiques et de la colipase dans l’hépatopancréas de crabe vert

1- Mise au point des activités lipasique et phospholipasique dans l’homogénat

Le céphalothorax de crabe débarrassé de sa cuticule, constitue le tissu biologique renferment l’hépatopancréas. A 1 g de tissu frais on ajoute 1 ml de tampon 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM benzamidine, pH 8, l’ensemble est traité à l’aide d’un mixeur (2 x 30s) à froid. Après centrifugation (10 min, 10000 rpm) l’activité est mesurée dans le surnageant.

Le taux de lipase de crabe vert mesuré sur une émulsion de tributyrine dans les conditions optimales est de 50 UI/ g de tissu frais. Alors que, l’activité phospholipasique mesurée sur une émulsion de phosphatidylcholine comme substrat, est de l’ordre de 10 UI/g de tissu frais.

Le tableau 2 montre que la lipase de crabe présente un niveau d’activité relativement faible par rapport à un invertébré comme celui de scorpion. Alors que les niveaux d’activité phospholipasique sont comparables.

Tableau 2 : Valeurs moyennes des activités lipasique et phospholipasique exprimée en UI/g de tissu frais d’hépatopancréas de crabe ou de scorpion.

Espèces animales

Activité lipasique

(UI/ g de tissu frais)

Activité phospholipasique

(UI/g de tissu frais)

Crabe vert

50

10

Scorpion (Nacim et al., 2005)

530

10

Ces résultats montrent que le crabe vert est équipé d’enzymes lipolytiques lui permettant d’hydrolyser les principaux lipides alimentaires : les triacylglycérols et les phospholipides.

2- Recherche de la colipase dans l’hépatopancréas de crabe

Il est bien connu, chez les animaux supérieurs, que la lipase pancréatique a besoin d’un cofacteur protéique thermostable pour s’exprimer. On a voulu savoir si la lipase de l’hépatopancréas de crabe a besoin d’une colipase pour agir, pour cela un homogénat d’hépatopancréas est traité à 65°C pendant 30 min pour inactiver la lipase. L’homogénat est ensuite centrifugé et utilisé pour tester la présence d’une colipase. L’utilisation d’un excès de cette solution ne permet pas de réactiver ni la lipase d’hépatopancréas de crabe inhibée par les sels biliaires ni la lipase pancréatique de dinde inhibée par NaTDC. Ces résultats sont en faveur de l’absence de la colipase dans l’hépatopancréas de crabe.

3- Recherche de sels biliaires dans l’hépatopancréas de crabe

A fin de mieux connaître les éléments impliqués dans la lipolyse et l’absorption des lipides chez les crabes, on a testé la présence de sels biliaires au niveau de l’hépatopancréas. L’expérience réalisée dans les conditions décrites précédemment montre que l’hépatopancréas de crabe ne présente pas de sels biliaires. Ce résultat confirme l’idée que les sels biliaires ne sont apparus que lorsqu’il y a une séparation de l’hépatopancréas en deux organes pancréas et foie.

II. Purification de la lipase de crabe vert

Préparation de l’homogénat

30 g de tissu frais de l’hépatopancréas de crabe sont homogénéisé dans 30 ml de tampon 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM benzamidine, pH 8 (tampon A) à l’aide d’un mixeur (Waring blender) 2 x 30 secondes puis centrifugé 30 min à 12000 rpm et à 4°C. L’activité lipasique est récupérée puis mesurée dans le surnageant sur la Tributyrine (TC4) dans les conditions optimales. Le protocole expérimental de purification de la lipase digestive de crabe (LDC) comporte les étapes suivantes.

1- Traitement à 60°C

Le surnageant récupéré après centrifugation contenant 1500 UT, subit un traitement thermique à 60°C pendant 10 min. La solution lipasique est alors centrifugée pendant 30 min à 12000 rpm et à 4°C. Le surnageant obtenu, contenant 80 % de l’activité de départ (1200 UT), constitue la charge de l’étape de chromatographie échangeuse d’anions (DEAE-cellulose).

2- Chromatographie échangeuse d’anions

Le surnageant contenant 1200UT est déposé sur une colonne de DEAE cellulose (20 x 2,5 cm) préalablement équilibrée dans le tampon A. L’enzyme ne s’adsorbe pas sur la matrice et il est élué et récupéré dans la phase de lavage. L’activité totale récupérée après cette étape est de 800 UT.

3- Précipitation au sulfate d’ammonium

La préparation enzymatique obtenue subit une précipitation fractionnée au sulfate d’ammonium entre 30% et 60% de saturation sous agitation à 4°C. Après 1 heure d’agitation, le milieu est centrifugé pendant 30 min à 12000 rpm à 4°C. Le culot est repris dans un minimum de tampon A. La solution obtenue contenant 500 UT constitue la charge de l’étape de filtration sur Séphacryl S-200.

4- Filtration sur Séphacryl S-200

La charge ainsi obtenue est déposée sur une colonne Séphacryl S-200 (2,5 x150 cm) préalablement équilibrée dans le tampon A. L’élution des protéines s’effectue avec le même tampon à un débit de 30 ml/h. Le profil d’élution, présenté sur la figure 4, montre que la LDC est éluée entre 1,3 et 1,5 V0.

Figure 4 : Profil d’élution de la LDC déposée sur une colonne de filtration Séphacryl S-200 équilibrée dans le tampon A. La charge (8 ml) contient 500 UT. Le débit est de 30 ml/h. Le volume de fraction est de 6 ml.

5- Chromatographie échangeuse d’anions : Mono Q-Sépharose

Après la filtration sur Séphacryl S-200, les fractions contenant l’activité lipasique (300 UT) sont rassemblées et déposées sur une colonne de Mono Q-Sépharose (3 x 10 cm) équilibrée dans le tampon 20 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 2 mM Benzamidine, pH 8 (tampon B). Les protéines fixées sont éluées avec un gradient linéaire de NaCl (20 mM à 350 mM). Le débit d’élution est de 45 ml/h.

Le profil d’élution présenté sur la figure 5, montre que la lipase est éluée à une concentration de NaCl comprise entre 200 mM et 250 mM.

Figure 5 : Profil d’élution de la LDC sur une colonne échangeuse d’anions Mono Q-Sépharose. La colonne (3 x 10 cm) est équilibrée avec le tampon B. Les protéines retenues sont éluées par 2×100 ml de gradient linéaire de NaCl (20 mM à 350 mM) dans le tampon B. Le débit est de 45 ml/h. le volume de fraction est de 3 ml.

6- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS

L’analyse par électrophorèse, de certaines fractions protéiques issues de la dernière étape sur gel de polyacrylamide dans les conditions dénaturantes, montre que la LDC se présente sous forme d’une seule bande de masse moléculaire 65 kDa (figure 6).

MT P1 P2 P3

96 kDa

67 kDa

43 kDa

30 kDa

20 kDa

14 kDa

Figure 6 :Electrophorèse sur gel de polyacrylamide à 12 % dans les conditions dénaturantes. Les échantillons (5U chacun) sont précipités par deux volumes d’acétones, le culot est ensuite repris dans le tampon dénaturant. MT : marqueur de taille ; P1, P2, P3 : fractions 57, 58 et 59 issues de la dernière étape de chromatographie.

7- Bilan de purification de la lipase de crabe vert

Tableau 3 : Le Bilan de purification de la LDC.

Etape de purification

Activité totale

(UT)

Protéines

(mg)a

AS

(UI/mg)

Rendement

Facteur de

purification

Homogénat

1500

16.5

3.03

100

1.00

Traitement T=60°C, 10 min

1200

1.96

12.2

80

4.02

DEAE cellulose

800

0.61

82

54

27

Précipitation

(NH4)2SO4 60%

500

0.48

104

34

34.3

Séphacryl S-200

300

0.07

210

20

69.3

Mono Q-Sépharose

150

0.05

500

10

165

a : le dosage des protéines est effectué par la méthode de Bradford (1976)

III- Caractérisation biochimique de la lipase digestive de crabe vert

1- Activité lipasique en fonction de la température

Il est bien établi que tous les enzymes lipolytiques du règne animal agissent à 37°C. A cette température une faible activité est décelée dans l’hépatopancréas de crabe. Par contre (figure 7) une augmentation de la température de 37°C à 60°C s’accompagne par une augmentation significative de l’activité lipolytique. Ce résultat surprenant mérite, dans l’avenir, d’être expliqué sur le plan physiologique et biochimique.

TC4/pH 8

Figure 7 : Profil d’hydrolyse d’une émulsion de TC4 par la LDC à températures croissantes.

2- Cinétique d’hydrolyse de la tributyrine et de l’huile d’olive

Pour avoir une idée sur le comportement aux interfaces de la LDC, on a suivi l’hydrolyse d’une émulsion de tributyrine (TC4) et d’une émulsion d’huile d’olive par la LDC en fonction du temps. Les résultats sont présentés dans la figure 8.

Figure 8 : Cinétique d’hydrolyse d’une émulsion de HO et de TC4 par la LDC. L’activité lipasique est mesurée à pH 8 et à 60°C.

Cette figure montre que quelque soit la longueur de la chaîne acyle du TG, la LDC présente une cinétique d’hydrolyse qui reste linéaire pendant 20 min. On peut donc conclure que malgré la tension interfaciale élevée à l’interface TC4/eau, et malgré l’accumulation des acides gras libres à chaînes longues à l’interface HO/eau, la LDC continue à hydrolyser efficacement ses substrats. Ces résultats montrent que la LDC est plus stable aux interfaces que la plupart des lipases pancréatiques (Gargouri et al., 1983 ;1984 a ; 1984 b ; 1985).

3- Effet du pH sur l’activité de la LDC

L’activité spécifique a été mesurée à différents pH et à 60°C

Figure 9 : Effet du pH sur l’activité de la LDC. L’activité lipasique est mesurée à différents pH et à 60°C sur une émulsion de tributyrine.

Ces résultats montrent que la LDC présente un pH optimum égale 8 et elle est capable d’agir dans un large spectre de pH compris entre 7 et 10. Une activité spécifique de 500 U/mg est obtenue à pH 8 en utilisant la tributyrine comme substrat.

4- Stabilité de la LDC en fonction de pH

La LDC a été incubée à température ambiante à différents pH et. L’activité lipasique est mesurée après 30 min d’incubation. La figure 10 montre que la LDC reste stable dans un large spectre de pH compris entre 5 et 9. Aux pH extrêmes l’enzyme est inactivé.

Figure 10 : Effet du pH sur la stabilité de la LDC. L’enzyme est incubé à différents pH dans différents tampons, à température ambiante. L’activité spécifique est mesurée sur la tributyrine comme substrat à pH 8 et à 60°C.

5- Effet de la température sur l’activité de la LDC

L’activité spécifique a été mesurée à différentes températures à pH 8.

Les résultats portés sur la figure 11 montrent que la LDC est pleinement active entre 40°C et 60°C. La température optimale est de 60°C. La LDC est inactivée au-delà de 65°C.

Figure 11 : Effet de la température sur l’activité de la LDC. L’activité lipasique est mesurée à pH 8 sur une émulsion de tributyrine à différentes températures.

6- Stabilité de la LDC en fonction de la température

L’effet de la température sur la stabilité de la LDC est présenté sur la figure 12, qui montre que l’enzyme reste stable et actif après une incubation de 15 min à une température inférieure à 50°C. A cette température 80% de l’activité lipasique est mesurée. Au-delà de 55°C la LDC est totalement inactivée quand elle est incubée en solution. Par contre quand l’enzyme est incubé en présence de son substrat (figure 11) il reste stable jusqu’à 60°C.

Ce résultat confirme que la présence de substrat protège l’enzyme de l’effet de la température. Ce phénomène est bien connu chez les enzymes qui agissent en milieu hétérogène.

Figure 12 : Effet de la température sur la stabilité de la LDC. L’enzyme est préincubé à différentes températures pendant 15 min. L’activité lipasique est mesurée sur une émulsion de tributyrine à pH 8 et à 60°C.

7- Effet de calcium sur l’activité de la LDC

L’activité spécifique a été mesurée en présence de concentrations croissantes de calcium. La figure 13 montre que la LDC est capable d’agir en absence de calcium. En effet, en présence de 10 mM d’EDTA, la LDC présente son activité maximale sur une émulsion d’huile d’olive ou de tributyrine comme substrat.

TC4

HO

Figure 13 : Effet de calcium sur l’activité de la LDC. L’activité lipasique est mesurée à pH 8 et à 60°C sur une émulsion de tributyrine ou d’huile d’olive. L’étoile indique l’activité de la LDC mesurée en présence de 10 mM EDTA.

8- Effet d’un composé amphipatique sur l’activité de la LDC

Dans le but d’avoir une idée sur le pouvoir de pénétration de la LDC, nous avons mesuré l’activité lipasique en présence d’un composé amphipatique naturel NaDC.

La figure 14 montre que la LDC perd son activité au fur et à mesure qu’on augmente la concentration du NaDC. L’inactivation totale est obtenue à 2 mM de NaDC. L’effet inhibiteur de NaDC dans le système tributyrine/eau ou huile/eau peut être relié à un changement de la qualité de l’interface qui diminue le pouvoir de pénétration de la LDC. L’enzyme est alors relargué dans la phase aqueuse (Gargouri et al., 1986).

Figure 14 : Effet de NaDC sur l’activité de la LDC. L’activité lipasique est mesurée à pH 8 et à 60°C sur une émulsion d’huile d’olive ou de tributyrine en présence de concentrations croissantes de NaDC.

L’addition de colipase pancréatique de dromadaire ne permet pas de réactiver la LDC ce qui est en faveur de l’absence d’homologie structurale entre la lipase pancréatique et la lipase purifiée à partir de l’hépatopancréas de crabe.

9- Immunoréactivité des anticorps polyclonaux anti-SDL et anti-TPL avec la LDC

On a voulu savoir si la LDC présente une certaine homologie structurale avec une lipase pancréatique classique ou d’une lipase d’Arthropode terrestre (le scorpion). Pour cela on a incubé la LDC en présence d’anticorps polyclonaux anti-SDL ou anti-TPL. Nos résultats montrent que les pAbs anti-TPL réagissent d’une manière spécifique avec la TPL, par contre aucun croisement n’est observé quand ces anticorps sont incubés avec la LDC. De la même manière les pAbs anti-SDL sont incapables de croiser avec la LDC.

On peut conclure qu’il n’existe pas de déterminants antigéniques communs entre la LDC et les lipases pancréatiques classiques d’une part et d’autre part entre la LDC et la lipase d’un invertébré terrestre.

La lipase de crabe peut être considérée comme un nouvel enzyme qui fera partie d’un groupe de lipases d’animaux peu évolués. La séquence de cet enzyme nous permettra de mieux établir la relation structure fonction de cette nouvelle classe d’enzymes.

SDL LDC TPL

Anti-TPL

TPL LDC SDL

Anti-SDL

Figure 15 : Crossimmuno-réactivité des anticorps polyclonaux anti-TPL ou anti-SDL

Conclusion et Perspectives

Dans ce présent travail, la purification et la caractérisation biochimique partielle de la lipase digestive de crabe (LDC) ont été réalisées.

Nos résultats montrent que :

§ La masse moléculaire de la LDC est de 65 kDa.

§ Contrairement à toutes les lipases de règne animal, La température optimale d’action de la LDC est de 60°C.

§ La cinétique d’hydrolyse d’une émulsion d’huile d’olive ou de tributyrine reste linéaire pendant 20 min.

§ L’activité spécifique de la LDC purifiée est de 500 UI/mg sur la tributyrine comme substrat.

§ Le calcium n’est pas nécessaire pour déclencher l’activité lipasique.

§ La LDC est stable et active entre pH 6 et 10 après 30 min d’incubation à température ambiante.

§ Le NaDC inhibe la LDC à une concentration de 2 mM.

§ Les résultats d’immunoréactivité de la LDC vis-à-vis de deux types d’anticorps polyclonaux anti-SDL et anti-TPL suggèrent que la LDC ne présente pas d’homologie structurale ni avec les lipases pancréatiques classiques ni avec une lipase d’un arthropode terrestre (le scorpion).

Perspectives :

§ Déterminer la séquence primaire de la LDC.

§ Déterminer et exprimer le gène qui code pour la LDC.

§ Modéliser ou cristalliser la LDC pour déterminer la structure tertiaire.

§ Approfondir l’étude immunologique.

Sommaire

Introduction 1

Etude bibliographique

I- Les enzymes lipolytiques 2

1- Introduction 2

2- Cinétique enzymatique de la lipolyse 2

II- Les lipases du monde marin 4

III- Les Crabes 5

1- Position systématique 5

2- Morphologie des crabes 5

3- Système digestif 5

Matériel & Méthodes

I- Matériel 7

1- Réactifs 7

2- Animaux 7

3- Protéines 7

4- Supports chromatographiques 7

5- Appareillage 7

II- Méthodes 7

1- Dosage de l’activité lipolytique 7

2- Dosage de l’activité phospholipasique 8

3- Détermination de la concentration en protéines 8

4- Effet de la température sur l’activité lipasique 8

5- Effet du pH sur l’activité lipasique 8

6- Stabilité de la lipase de crabe en fonction de la température 8

7- Stabilité de la lipase de crabe en fonction du pH 8

8- Effet des ions calcium 9

9- Effet du détergent naturel sur l’activité lipasique 9

10- Dosage des sels biliaires dans l’hépatopancréas de crabe 9

a) Préparation de la solution (Enzyme/NAD+) au moment de l’expérience 9

b) Dosage des échantillons 9

11-Analyse des protéines par électrophorèse et immunorévélation 9

Résultats & Discussion

I- Niveau des enzymes lipolytiques et de la colipase dans l’hépatopancréas de crabe vert 10

1- Mise au point des activités lipasique et phospholipasique dans l’homogénat 10

2- Recherche de la colipase dans l’hépatopancréas de crabe 10

3- Recherche de sels biliaires dans l’hépatopancréas de crabe 11

II. Purification de la lipase de crabe vert 11

Préparation de l’homogénat 11

1- Traitement à 60°C 11

2- Chromatographie échangeuse d’anions 11

3- Précipitation au sulfate d’ammonium 11

4- Filtration sur Séphacryl S-200 12

5- Chromatographie échangeuse d’anions : Mono Q-Sépharose 12

6- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS 13

7- Bilan de purification de la lipase de crabe vert 14

III- Caractérisation biochimique de la lipase digestive de crabe vert 14

1- Activité lipasique en fonction de la température 14

2- Cinétique d’hydrolyse de la tributyrine et de l’huile d’olive 15

3- Effet du pH sur l’activité de la LDC 15

4- Stabilité de la LDC en fonction de pH 16

5- Effet de la température sur l’activité de la LDC 16

6- Stabilité de la LDC en fonction de la température 17

7- Effet de calcium sur l’activité de la LDC 17

8- Effet d’un composé amphipatique sur l’activité de la LDC 18

9- Immunoréactivité des anticorps polyclonaux anti-SDL et anti-TPL avec la LDC 19

Conclusion & Perspectives

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Résumé

La plupart des recherches actuelles sont focalisées à l’étude des lipases des animaux supérieurs. On ignore jusqu’à ce jour le mode d’action du système lipolytique des animaux primitifs marins. Pour cette raison nous nous sommes intéressés, dans ce présent travail, à la purification et à la caractérisation biochimique de la lipase de crabe impliquée dans la digestion des lipides alimentaires.

Les crabes verts, utilisés dans cette étude, comptent parmi les animaux marins les plus primitifs. Leur apparition remonte à l’ère secondaire (-250 à -60 millions d’années).

La lipase digestive de crabe (LDC) a été purifiée à partir de l’hépatopancréas. Elle apparaît sous forme d’un polypeptide de 65 kDa. L’activité spécifique de l’enzyme purifié, mesurée sur la tributyrine, est de 500 UI/mg à pH 8 et à 60°C.

L’étude de quelques caractéristiques biochimiques de l’enzyme montre que :

Ø La LDC est une vraie lipase. Elle dégrade les TG à chaînes longues.

Ø Contrairement à toutes les lipases de règne animal, La LDC présente une température optimale d’action de 60°C.

Ø La LDC est stable et active entre pH 6 et 10 après 30 min d’incubation à température ambiante.

Ø Le calcium n’est pas nécessaire pour déclencher l’activité lipasique.

Ø La LDC ne présente pas d’homologie structurale ni avec les lipases pancréatiques classiques ni avec une lipase d’un arthropode terrestre (le scorpion).

Mots clefs :

Animal primitif marin, hépatopancréas, lipase de crabe, purification, homologie structurale.

ABREVIATIONS

LDC : lipase digestive de crabe

SDL : lipase digestive de scorpion

TPL : lipase pancréatique de dinde

pAbs : anticorps polyclonaux

TG : triacylglycérol

H.O. : huile d’olive

TC4 : tributyrine

NaDC : déoxycholate de sodium

NaTDC : taurodéoxycholate de sodium

EDTA : l’acide éthylène diamine tétra-acétique

AS : activité spécifique

Da : dalton

MM : masse moléculaire

rpm : rotation par minute

h : heure

min : minute

s : seconde

UI : unité enzymatique internationale

DO : densité optique

SB : sels biliaires

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